گام اول در برنامه‌های به‌نژادی، تعیین تنوع ژنتیکی مواد اصلاحی است. بررسی تنوع ژنتیکی توتون برای برنامه‌های اصلاحی و حفاظت از ذخایر ژنتیکی، امری حیاتی بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی در ژنوتیپ‌های توتون برای انتخاب والدین در برنامه‌های اصلاحی از اهمیت زیادی برخوردار است. استفاده از نشانگرهای مولکولی، سبب کاهش مدت زمان اصلاح و هزینه‌های پروژه‌های اصلاحی می‌شود. در این تحقیق، تنوع ژنتیکی 100 ژنوتیپ گیاه توتون با استفاده از 25 نشانگر ISSR ارزیابی شد. الگوی نواربندی بر اساس وجود و عدم وجود نوارها به‌ترتیب با یک و صفر نشان داده شدند. از تعداد 237 قطعه‌‌ای که درکل ارقام تولید شدند، تعداد 195 قطعه چندشکل بودند و میانگین چند‌شکلی از 4 تا 12 به ازای هر آغازگر متفاوت بود. میانگین درصد چندشکلی تعیین شده در مجموع ژنوتیپ‌های مورد بررسی 10/94 بود. به‌منظور تعیین کارایی نشانگرها، محتوای اطلاعاتی چندشکلی (PIC) و همچنین درصد چندشکلی آن‌ها محاسبه شد. آغازگرهای UBC815، UBC812 و UBC878 با دارا بودن بهترین پارامترهای نشانگری به عنوان بهترین آغازگرها جهت بررسی تنوع ژنتیکی در این تحقیق معرفی شدند. به‌منظور ارزیابی تشابه ژنتیکی بین ارقام، ضرایب تشابه مختلفDice ،Jaccard  و SM محاسبه شده و آزمون تطابق مانتل انجام و دندروگرام براساس ضریب تشابه SM و الگوریتم UPGMA ترسیم شد. ضریب کوفنتیک بدست آمده برابر 9632/0 بود. همه ژنوتیپ‌های مورد بررسی تشکیل دو خوشه‌ی مجزا دادند که بیانگر کارایی بالای آغازگرهای مورد استفاده در تکثیر قطعات مناسب از ژنوم بود. تجزیه به مختصات اصلی نشان داد که سه مولفه اول توانستند در مجموع 65/79 درصد از واریانس کل را توجیه کنند. با توجه به اهداف این تحقیق، می‌توان به این نتیجه رسید که بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپ‌های توتون با استفاده از نشانگر ISSR مفید بوده و نشانگر ISSR می‌تواند به عنوان یک سیستم نشانگر مناسب جهت تشخیص تنوع و روابط ژنتیکی در اصلاح این گیاه مورد استفاده قرار گیرد.